發布時間：2021/6/1 8:41:52 閱讀次數：1249
ELISA試劑盒開發
ELISA試劑盒法檢測具有高速 快捷 易批量操作等優點,不同的生產廠家提供不同種類,不同類型的Elisa試劑盒產品,為科研用戶帶來極大的方便.
鐘鼎生物的 ZoonKit能夠針對特定檢測源,制備特異性抗原抗體,根據應用需要量身定制檢測試劑盒,有效控制檢測試劑成本.我們恪守ELISA試劑盒開發的八大質控原則,成功的為水產 畜禽疫病檢測科研用戶開發高敏 經濟 實用的疫病檢測試
劑盒.
第一部分: 項目溝通
了解項目背景及預期目標確定開發方案及計劃.
可根據您的個性化需要開發特定ELISA 試劑盒.可采用ELISA夾心法 競爭法（測定抗原） 間接法（測定抗體）或競爭法（測定小分子化合物）定量檢測目標物的含量.
第二部分：免疫原制備
1 分析目標蛋白的基因和氨基酸序列,進行抗原性及表達分析,密碼子優化,完成全基因合成.
2 構建重組蛋白的原核表達載體.
3 轉化E. Coli體系,進行重組蛋白表達誘導和鎳柱親合純化,獲得1～3mg純化重組蛋白,純度>85%.（如需需要真核表達系統表達,鐘鼎亦可提供相關服務）
4 制備免疫原用于動物免疫.
如為小分靶標,則通過結構分析進行分子修飾并偶聯載體蛋白用于免疫及檢測.
第三部分：制備抗體
根據項目溝通結果確定制備抗體的種類,一般夾心ELISA需要不同表位的抗體用做配對,建議同時進行多克隆抗體和單克隆抗體的制備.確保高速的獲得高靈敏度的配對方式.其他類型的ELISA根據具體情況選擇.
1 實驗動物免疫
使用第一部分制備的免疫原免疫2只新西蘭兔和5只BALB/c鼠分別用于多克隆抗體及單克隆抗體的制備.免疫4-5次,收集抗血清檢測效價,ELISA效價大于10萬以上進行多克隆抗血清收集及單克隆抗體雜交瘤制備.
2 單克隆抗體雜交瘤制備
選擇與重組蛋白和天然蛋白免疫反應最強的小鼠進行細胞融合,通過ELISA篩選陽性克隆,將陽性克隆進行亞克隆獲得陽性細胞株.將陽性克隆上清進行表位鑒定,反應性鑒定及親和力鑒定.選擇不同表位,反應性強且親和力高的細胞株進行后續抗體生產.
3 抗體生產
多克隆抗血清進行抗原親和純化,獲得特異性抗體10-20 mg.單克隆抗體生產選擇所需陽性細胞株進行細胞擴增,腹水制備,通過蛋白A親和純化獲得3-5 mg 純化抗體.
第四部分：ELISA 試劑盒制備
1 抗原或抗體標記
根據開發ELISA的類型確定標記抗原或者抗體.一般標記HRP 或者生物素.
2 抗原抗體使用濃度優化
檢測不同濃度抗原與抗體的反應靈敏度,特異性.確定更好的抗原與抗體的使用濃度.
3 包被條件及反應條件優化
確定包被緩沖液,洗滌緩沖液及酶結合物保存液；確定抗體反應溫度及反應時間.
4 回收率測定
將標準品加入陰性樣品中確定回收率,需達到80%-120%的回收范圍.
5 批間差及批內差測定
重復性檢測,批間差及批內差需小于15%.
6 穩定性測試
通過37度破壞性試驗檢測試劑盒在37度條件下3天,7天,10天,14天的表現.同時4度留樣以備長期檢測.一般試劑盒可在4度存放1年.
7 臨床樣品或真實樣本檢測
將客戶提供的其他方法驗證的陽性樣品和陰性樣品進行重復驗證檢測,確定符合率.
8 試劑盒組裝
組裝5份ELISA試劑盒包括所有組分及說明書
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